一般酶標儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，可以滿足ELISA的顯色測定。ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯苯醌。當pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收，當pH值降為L0時，最大吸收波長移至492nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產物聯苯醌在波長450nm處有最大消光系數，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min。因此，450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉換的部件，可以同時安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應包括上述兩個波長，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。
除了這兩個基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據自己的需要選擇。有時，有的實驗室希望用酶標儀作微量生化測定，故酶標儀生產廠家對其生產的酶標儀擴展了紫外檢測功能，此時需要一個340nm波長濾光片。此時，酶標儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標儀有單波長和雙波長檢測功能。有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定；而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定外，同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進行測定，酶標儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長，且不必設空白孔。
